差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry, 简称DSF），是在荧光定量PCR仪上缓慢加热样品，在加热的过程中检测荧光染料与结构发生改变的蛋白质相结合的量，来评价蛋白质热稳定性的方法。该方法具有蛋白样品损耗少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。
01 DSF原理
DSF可以通过荧光染料或蛋白内源荧光信号监测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（折叠蛋白与去折叠蛋白相等时的温度）。染料法DSF最常用的是SYPRO Orange染料，SYPRO Orange 是一种环境敏感的疏水染料，当温度升高时，蛋白去折叠，疏水部分暴露出来，染料与蛋白质的疏水部分特异性结合，荧光增强。在有特定化合物或配体结合的情况下，蛋白稳定性会上升，表现为熔解温度的上升。
图1. 染料法DSF
无标记DSF (Nano DSF）则是基于蛋白去折叠过程中色氨酸发射光谱的位移进行检测。因此，通过检测荧光变化，可实现在非标记环境下评估蛋白质热稳定性、化学稳定性、胶体稳定性、等温稳定性、变复性能力等性质。
图2. Nano DSF
02 DSF测试过程
1、仪器准备
DSF 主要是利用荧光定量 PCR 仪在 96 孔或 384 孔 PCR 板上完成平行检测，以实现高通量筛选目的蛋白和化合物。
2、样品准备
蛋白样品需要较高的纯度（～75%），化合物的纯度通过 LC-MS 质检；SYPRO Orange 是目前DSF实验中应用最广泛的染料，方便且高效。此外，也有一些特殊的染料用于特定蛋白的研究，例如 1,8-ANS、2,6-ANS、2,6-TNS、oxazole 系列和 BODIPY、BFC 系列染料探针。
3、反应体系配置
根据实验设计把蛋白和配体配置成不同浓度的体系，置于 96 孔板或 384 孔板。缓冲液可以根据实际需要进行更换。DSF 的反应体系主要包括蛋白样品、反应缓冲液、荧光染料及候选的化合物配体，每检测孔样品体积为 20～25 µL，以蛋白缓冲液作为空白对照，每个检测组设三组重复。
4、上机
将上述配置好的体系放入荧光定量 PCR 仪中，激发和发射波长分别调至荧光染料相应波长， 升温速率通常设为 1 ℃/10s，温度变化范围一般从 25 ℃ 到 75 ℃ 或 100 ℃ 不等，每 1～3 ℃ 测定一次荧光强度（实验条件会根据实际情况优化）。
5、数据分析
通过数据处理软件，绘制出荧光强度随温度的变化曲线，通过拟合波尔兹曼（Boltzmann transport equation，BTE）方程，计算出蛋白样品的 Tm 值及相关参数。
03 DSF优点
1、Nano DSF无需染料：直接检测蛋白紫外荧光；
2、初步或者大量检测蛋白与化合物之间是否有结合力；
3、低样品消耗量：每个样品仅需10 μL，最低浓度仅需0.5 μg/mL；
4、数据精度高：CV<0.1% (Tm)；
5、温度变化范围广。
04 DSF应用
1、蛋白质稳定性评估
大多数蛋白质对温度要求较高，评估其热稳定性对更好地发挥其功能非常重要。DSF不但可以高通量测定蛋白质的热稳定参数，还能评估突变、pH、离子强度等其他因素对热稳定性的影响，筛选出提高热稳定性的因素。
图3. DSF检测不同 pH 对蛋白热稳定性的影响
2、蛋白质结构研究
蛋白质结晶是研究蛋白质结构的一个非常重要的手段，DSF可以高通量筛选蛋白质的结晶条件。
3、蛋白质-配体相互作用研究
配体与蛋白质结合一般会导致蛋白质的热稳定性改变，DSF可以通过测定蛋白质的热稳定性参数评估配体与蛋白质之间的相互作用。
4、蛋白质稳定剂、抑制剂的高通量筛选
通过对化合物配体库进行高通量筛选，获得与蛋白样品相结合的候选化合物，评估化合物对蛋白稳定性的影响，从而筛选出蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子及分子伴侣。
图4. DSF检测蛋白与配体的结合
5、小分子化合物抑制机制研究
利用 DSF 可以进行高通量、矩阵式的多种化合物检测（化合物与一些已知的抑制剂、底物、产物或辅助因子等结合），用于小分子化合物抑制剂的筛选及其药理机制的研究。
